Protocolo Tcg4

NOTA: Antes de comenzar es recomendable preparar la reacción sobre hielo. Todos los materiales deben estar estériles y limpios. Todo el procedimiento debe ser llevado a cabo dentro de la campana negra (previamente limpia con solución agua: cloro y esterilizada con UV durante 15 min)

Prepare los tubos que habrá de utilizar para su PCR en una gradilla. NOTA: Preferentemente NO etiquete la tapa del tubo ya que se puede borrar, mejor etiquete en los costados

Realice los cálculos de para preparar las reacciones necesarias (En este caso son 5 reacciones cada una con su control correspondiente, en total 10).

Agregue cada componente de la tabla 1 en orden descendente en un tubo y marque como MasterMix (no agregar ADN ni primers). NOTA: coloque la polimersa al final. Saque del congeador la enzima y regresela inmediatamente después.

TABLA 1: Reactivos para PCR MasterMix

A	B	C
Reactivos	Una reacción	10 reacciones
Agua libre de nucleasas	40.75 μL	407.5 μL
Buffer 10x plus Mg	5 μL	50 μL
dNTPs	1 μL	10 μL
Taq polimerasa	.25 μL	2.5 μL

• Se empelo el Kit PCR Reagent System

A	B
Primers	2.5μL (1.25 μL de c/u)
ADN molde	.5 μL

Coloque la cantidad correspondiente del MasterMixa cada uno de los tubos (47μL).

Posteriormente coloque en cada tubo  los primers  y el ADN ha utilizar (volumen total de cada tubo 50 μL) NOTA: A los controles negativos no coloque  ADN, en su lugar agregue agua libre de nucleasas.

Coloque los tubos en el termociclador ya programado con las condiciones de la PCR (ver tablas abajo).

Condiciones del Termociclador

A	B	C
Pasos	Temperatura	Tiempo
Desnaturalización inicial	94 OC	3min
Desnaturalización	94 OC	45s
Hibridación	53 OC	30s
Extensión	72 OC	1 min
Incubación final	72 OC	10min
	4 OC	infinito
30 ciclos

Al terminar su PCR analice su producto en electroforesis.