Electroforesis de proteínas y Western blot DENV
Delia Piedad Recalde-Reyes, Juliana Lopez Calderon
Abstract
Una prueba tipo Western Blot (también conocida como inmunotransferencia) es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. El procedimiento consiste en separar las proteínas de la muestra en función de su tamaño mediante la técnica de electroforesis para luego ser transferida a una membrana de polivinilo.
La membrana se somete a una serie de pasos de bloqueo y lavado para eliminar las proteínas no específicas y prevenir la unión no específica de anticuerpos en la muestra. Se añade un primer anticuerpo específico que se unen a la proteína de interés y un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario.
Finalmente, se utiliza un sustrato químico que reacciona con el anticuerpo secundario para producir una señal visual que indica la presencia de la proteína de interés. La intensidad de la señal visual está relacionada con la cantidad de proteína presente en la muestra.
Este protocolo fue desarrollado gracias al apoyo administrativo de la CUE Alexander von Humboldt de Armenia y desarrollado dentro de la convocatoria de Minciencia 917 de estancia en investigación: Desarrollo de una prueba tipo Western blot, Dot blot e Inmunofluorescencia para detección de antígenos virales de dengue serotipos 1 – 4.
Before start
Preparar todos los medios y reactivos necesarios para usar en el inmunoensayo. Asegúrese de contar con la candad suficientes para cada uno de los pasos.
Steps
Gel de electroforesis de proteínas (Denaturante) al 10% (Volumenes suficientes para 2 geles)
Preparar gel de resolución empleando
Acrilamida bis acrilamida 40% 2.5mL
1.5M Tris HCl pH 8.8 2.5mL
SDS 10% 100µL
Agua destilada 4.845mL
TEMED 5µL
PSA 10% 50µL
VOLUMEN TOTAL 10mL
Después de adicionar los reactivos en la cámara de proteínas puede adicionarse 300µL de metanol absoluto para favorecer la polimerización del gel.
Gel de empaquetamiento (staking) al 4% (Volumenes suficientes para 2 geles)
Acrilamida bis acrilamida 40% 0.5mL
1.5M Tris HCl pH 6.8 1.25mL
SDS 10% 50µL
Agua destilada 3.160mL
TEMED 5µL
PSA 10% 25µL
VOLUMEN TOTAL 5mL
Correr el gel a 80 voltios( 8 voltios por cada cm de gel ) hasta que termine la corrida en el gel de empaquetamiento.
Posteriormente correr entre 12 a 15 voltios por cm de gel (entre 120 a 150 voltios) durante 60 minutos.
Si esta corriendo un gel a 30mAmp y para 2 geles 60mAmp.
Preparación de la muestra
Preparación buffer carga 2X
SDS al 10% 6mL
Glicerol al 50% 15mL
Azul de bromofenol al 1% 0.3mL
0.5 M Tris HCl pH 6.8 3.75mL
Agua destilada ajustar a 30mL
Adicionar B mercaptoetanol a 950µL de muestra antes de usar.
Protocolo tomado y adaptado de BioRad.
Adicion buffer carga a la muestra
Para 10µLde muestra añadir:
5µL de muestra (entre 5µg a 10µg de proteína total para un minigel o determinar concentración de proteínas por BCA.
4.75µL de buffer carga
0.25µL de betamercaptoetanol
Total muestra 10µL
Calentar muestra 90°C-100°C durante 0h 5m 0s ó a 70°C durante 0h 10m 0s
Cargar muestra a cada pozo 10µL
Transferencia semi seca de proteínas
Buffer de transferencia 1L
3.029gde Tris Base
14.263gde glicina
Diluir empleando agua destilada, ajustar volumen hasta 700mL
Verificar pH a 8.3 o ajustar hasta alcanzar un volumen de 800mL
Llevar a 1000mLempleando 200mL de metanol absoluto.
Para realizar la transferencia del gel de proteinas a la membrana se debe hidratar previamente la membrana sumergiendola durante 0h 5m 0s en metanol absoluto, posterior a esto poner en contacto la membrana de polivinilo con el gel de electroforesis.
Eliminar las burbujas restantes entre gel membrana
Tanto gel como membrana deben ponerse sobre papel filtro BioRad Cat. 1703960
El papel filtro debe sumergirse previamente en buffer de transferencia a 4°Cdurante 0h 5m 0s
El orden de los elementos debe ser el siguiente desde la parte superior hasta la inferior
Papel filtro
Gel
Membrana de polivinilo 0.45um
Papel filtro
La trasferencia se realiza en equipo trans tubo blot de BioRad empleando el protocolo éstandar preestablecido para 2 mini geles
25 voltios - 1.0A - 0h 30m 0s
Bloqueo membrana de PVDF
Cada membrana sensibilizada fue bloqueada empleando leche descremada al 5%, disuelta en TBS-T.
Adición anticuerpo primario
Se emplearon sueros de origen humano previamente determinados por kit comerciales como
Positivos para DENV y Negativos para DENV.
Estos anticuerpos fueron diluidos 1:200 empleando solución de bloqueo.
La reacción fue incubada durante 2h 0m 0s a temperatura ambiente 20°C en agitación constante 120rpm.
Lavados
Se realiza lavado de la membrana con 5mL de TBS- Tween- 0,05% (TBS-T) por 0h 5m 0s, este proceso se repite tres veces.
Anticuerpo secundario
El anticuerpo secundario (Anti human Sigma Cat. A8542) fue diluido 1:5000 en TBS-T con azida de sodio (NaN3) al 0,03%.
Lavados
Se realiza lavado de la membrana con 5mL de TBS- Tween- 0,05% (TBS-T) por 0h 5m 0s, este proceso se repite tres veces.
Para revelar la reacción se empleó sustrato (BCIP/NBT) Thermo Scientific Ref: 34042, la reacción se incubó a 37°C durante 0h 5m 0s.
La reacción se detuvo empleando agua destilada.
Las membranas se secaron a temperatura ambiente por 0h 5m 0s.
Lectura de los resultados
