frascos erlenmeyer de 500 ml

O número de frascos erlenmeyer vai variar de acordo com o número de amostras que serão produzidas:

• X amostras em quintuplicatas (x5) +
• Controle ( CCMR0280 ) em quintuplicatas (x5) +
• Branco de meio (1 frasco erlenmeyer tratado da mesma forma com meio e adição de nutrientes, mas apenas sem a etapa de inoculação)

por exemplo: Vamos comparar 3 espécies diferentes, então usaremos (3*5) + 5 + 1 (=21) frascos

Iniciar a criação e preenchimento do arquivo Metadata :

• código das amostras;
• código das cepas;
• espécie;
• meios de cultivo;
• data de início;
• data de coleta da biomassa;
• método de extração 1;
• método de extração 2;
• comentários

Preparo de soluções Estoque:

Solução estoque de NaNO₃ :

• Em um frasco previamente lavado (com extran 5% e rinsado a exaustão com água destilada), adicionar 7.5 g de NaNO₃ (MARCA e PartNumber) a 100 ml de água destilada
• Uso: 1 ml para cada 1 litro de meio.

Solução estoque de NaH2PO4•H2O : ₂PO₄•H₂O :

• Em um frasco previamente lavado (com extran 5% e rinsado a exaustão com água destilada), adicionar 0.5 g de NaH₂PO₄•H₂O a 100 ml de água destilada
• Uso: 1 ml para cada 1 litro de meio.

Solução de Metais-traço:

• Em um frasco previamente lavado (com extran 5% e rinsado a exaustão com água destilada), adicionar:

1. 23 mg de ZnSO₄•7H₂O
2. 152 mg de MnSO₄•H₂O
3. 7.3 mg de Na₂mOO4•2H₂O
4. 14 mg de CoSO₄•7H₂O
5. 6.8 mg de CuCl₂•2H₂O
6. 4.6 g de Fe(NH₄)2(SO4)2•6H₂O
7. 4.4 g de Na₂EDTA•2H₂O
8. E completar o volume com água destilada até 1 litro

• Uso: 1 ml para cada 1 litro de meio.

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Preparo da solução de vitaminas:

• Em um frasco previamente lavado (com extran 5% e rinsado a exaustão com água destilada), adicionar:

1. 200 mg de Thiamina
2. 10 ml (0.1 g) de Biotina
3. 1 ml (1g/l) de Cyanocobalamine
4. E completar o volume com água destilada até 1 litro

• Uso: 0.5 ml para cada 1 litro de meio (após autoclave)

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Preparo do meio de cultivo F/2:

• Para 1 litro de água destilada:

1. 41,5 gramas de sal marinho para aquario (Reef Salt)
2. 1 mL de solução de NaNO3
3. 1 mL de solução de NaH2PO4•H2O
4. 1 mL de solução de metais traço
5. Autoclave: 15 minutos 1.5 ATM
6. Espera esfriar
7. Adiciona a solução de vitaminas antes do uso.

Preparo de solução de nutrientes:

• 20 ml
• 20 ml
• 1 ml de vitaminas
• 1 ml de metais
• filtra em 0.22 um

Preparo das rolhas de algodão:

• Material a ser utilizado: algodão hidrófobo, gaze, tesoura, barbante

1. Corte um pedaço de gaze do tamanho da palma da sua mão;
2. Abra a gaze e insira parte dela dentro do frasco;
3. Coloque, dentro da gaze que estão dentro da boca do frasco, o algodão hidrofóbico;
4. Continue inserindo algodão até que, quando tirar a gaze com o algodão do frasco, seja feito um barulho semelhante a: “puf” (barulho ocasionado pelo vácuo causado pela rolha);
5. Corte um pedaço de barbante;
6. Amarre a gaze com o barbante (faça isso bem em cima do algodão colocado, ou seja, não deixe espaço);
7. Corte o excesso de barbante e de gaze;
8. Verifique se a rolha está um pouco acima da boca do vidro;
9. Caso a resposta do item anterior seja negativa, suba um pouco ela;
10. Autoclave: 15 minutos 1.5 ATM
11. Seque na estufa o frasco tampado com as rolhas de algodão por entre 8-12 horas a 70°C;

Separar todos (# ) os frascos erlenmeyer de 500 ml

• Lavá-los com Extran 5%
• Rinsa-los em excesso com água destilada

Atenção ao número de cepas e réplicas a serem cultivadas

Preparar as rolhas com algodão para vedar o cultivo

Autoclavar os frascos previamente lavados com as rolhas de algodão

• Depois secar em estufa (frasco com rolhas): 24 horas a 70oC

Autoclavar os frascos tipo Schott com 1 L do meio de cultivo F/2

• por exemplo para 21 frascos: 21 x 200 ml = 4.2 litros (5 litros)
• Fazer em frasco becher de 5 litros
• Dividir em frascos Schott de 1 litro
• Autoclave: 15 minutos 1.5 ATM

Após o meio resfriar, adicionar 0,5 mL de solução de vitaminas (previamente filtrada em filtro de seringa: 0.22 um )

• não vale o filtro de seringa 0.45 um

Identificar cada frasco erlenmeyer com etiquetas contendo código (rastreável a lista de amostras do projeto) e data de produção

• as datas de produção de cada espécime, de adição da solução de nutrientes, de coletas das biomassas, etc deverão ser documentadas na lista de amostras do projeto.

Com o auxílio de alças estéreis coletar a biomassa de um cultivo já preparado.

• Quantidade: "tufo" do tamanho de uma moeda de 50 centavos
• Importante: Tudo deve ser feito utilizando luvas descartáveis e evitando o fluxo de ar
• Vedar bem os frascos erlenmeyer com as rolhas de algodão previamente preparadas

Para manter as cianos em fase log deve-se alimentá-las com frequência adicionando a solução de nutrientes preparada previamente (ítem # ).

• Para cada cultivo o recomendado é de 200 $$μL da solução de nutrientes
• É possível observar que as cianos precisam de nutrientes pela cor verde delas

Rotina de adição da solução de nutrientes:

• A cada semana
• Anotar na folha de controle de adição da solução de nutrientes

O tempo de cultivo será estabelecido como sendo:

• 4 semanas ou 28 dias
• Com adição da solução de nutrientes a cada 7 dias

Ao final dos 28 dias, de cada frasco erlenmeyer, será retirada uma quantidade visualmente equivalente a 80-90% da biomassa.

• Vamos permitir que cada espécime se mantenha crescendo até que seja necessário interromper
• a princípio, podemos estabelecer um limite de 4 meses para cada espécime

Procedimento para retirada do meio:

• Centrifugação:
• Filtração:

Liofilizar cada amostra devidamente identificada em separado

• Adicionar detalhes e comentários ao Metadata