Técnica de inmunofluorescencia indirecta para detección de dengue virus
Delia Piedad Recalde-Reyes, Juliana Lopez Calderon
Abstract
La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una técnica para detectar la presencia de anticuerpos en una muestra. Esta se debe a la unión de anticuerpos fluorescentes a los anticuerpos presentes en la muestra, lo que permite la detección visual de estos.
Para la visualización, se aplican anticuerpos fluorescentes a un portaobjetos de vidrio que contiene una muestra fijada y se observa con un microscopio de fluorescencia.
Si hay anticuerpos en la muestra que se unen a los anticuerpos fluorescentes, se produce una fluorescencia indicando la presencia de anticuerpos.
Este protocolo fue desarrollado gracias al apoyo administrativo de la CUE Alexander von Humboldt de Armenia y desarrollado dentro de la convocatoria de Minciencia 917 de estancia en investigación: Desarrollo de una prueba tipo Western blot, Dot blot e Inmunofluorescencia para detección de antígenos virales de dengue serotipos 1 – 4.
Before start
Cumplir con todas las medidas de bioseguridad. Preparar todos los medios y reactivos necesarios para usar en el inmunoensayo. Asegúrese de contar con la candad suficientes para cada uno de los pasos.
Steps
Mantenimiento línea celular BHK
Para obtener celulas BHK, se requiere
Se emplea una caja de 24 pozos para trabajar con células BHK (RPMI), se usará vidrio para cada uno de los pozos.
Se adiciona 100.000 células por cada uno de los pozos.
Infección viral de células eucariotas
Se realiza la infección con virus dengue 2 (DENV 2) con un Moi=1, y se deja la interacción virus-célula durante 2h 0m 0s a 37°C.
Pasado el tiempo, se retira el inóculo y se adiciona medio de mantenimiento 200µL.
Se deja 24h 0m 0s en cámara húmeda a 37°C .
Lavado
Al día siguiente, se realizan 2 a 3 lavados con 200µL de solución salina 0.9%.
Fijación
Se hará fijación con 200µL paraformaldehido al 4%, se incuba a 4°C durante 0h 10m 0s, después se realizan 2 lavados con solución salina 0.9%.
NH4Cl 50 milimolar disuelto en PBS o solución salina 1X 200µL durante 0h 10m 0s (se elimina la fluorescencia inespecífica a temperatura ambiente.)
Permeabilización
La permeabilización se realizará con tritón X100 al 0,5% disuelto en PBS o solución salina 1X, 200µL por pozo.
Se incuba durante 0h 5m 0s a 37°C. Posteriormente se realizan 2 lavados con solución salina y se deja 0h 10m 0s.
Seguido se realizará bloqueo PBS O SSN 1X o leche descremada al 5% durante 0h 45m 0s a 37°C.
Anticuerpo primario
Se adicionan los anticuerpos (ANTICUERPO PRIMARIO)
● Anti NS1 1:10.000 disuelto en PBS 1X
Se dejarán en interacción durante 0h 40m 0s a 37°C. Después lavado 3 veces con PBS 1X se dejan 3 minutos cada lavado.
Finalmente se adicionaron los anticuerpos (ANTICUERPO PRIMARIO)
● Anti NS1 1:10.000 disuelto en PBS 1X
● Anti ENV 1:5.000 disuelto en PBS 1X
Anticuerpos de rato los cuales se dejarán en interacción durante 40 minutos a 37 grados. Después lavado 3 veces con PBS 1X se dejan 3 minutos cada lavado.
ANTICUERPO SECUNDARIO
1.Anticuerpo secundario anti-mouse, Fitc 1:200, se deja incubando media hora a 37 grados
2.Prepara ssn de Hoesht 1 uL en 1000 mL 1X PBS5 minutos a 37 grados. 2 lavados con PBS 1 X
3.50 um sobre láminaportaobjetos cada vidrio sobre la lámina. Se deja reposar 24 h.
