Análise filogenômica

A primeira etapa da construção da árvore filogenômica consiste em baixar os genomas que serão analisados. Para isso, é necessário visitar a pagina Genome do NCBI no link https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/. Digite o nome das espécies de interesse e anote, em uma tabela ou planilha, os respectivos nomes e os identificadores do Genbank, que começam com GCA_. Essa tabela ou planilha será fornecida como material suplementar do artigo. Obs: lembre-se de incluir o genoma do outgroup da árvore.

Após anotar os identificadores de todos os genomas, copie e cole apenas os identificadores em um arquivo chamado accessions.txt. Um identificador por linha.

Feito isso, vamos rodar o script genbank_assembly_downloader.py genbank_assembly_downloader.py para baixar os genomas cujo identificador está presente no arquivo accessions.txt

python genbank_assembly_downloader.py

O script irá criar um diretório chamado downloads e dentro dele serão salvos todos os arquivos fasta correspondentes a cada genoma. Os arquivos serão nomeados com seus respectivos códigos. Sugiro renomear estes arquivos com o nome das espécies como no exemplo:

mv GCA_030450195.1_ASM3045019v1_genomic.fna Saccharomycopsis_praedatoria_UFMG-CM-Y6991_genomic.fna

A construção da árvore será feita a partir do alinhamento múltiplo de todas as proteínas ortólogas de cópia simples (single-copies or 1:1) presentes em todos os genomas. Para identificá-las vamos utilizar o software BUSCO. Vamos rodá-lo de forma automatizada, com o script busco_run.py.

Será necessário editar o script para ajustá-lo à sua realidade. Parâmetros como busco_lineage , download_path , output_dir e --cpu . Considerando que todos os arquivos fasta dos genomas estão no diretório atual de trabalho, rode:

python busco_run.py
```Será criado um diretório de output contendo todos os resultados de todos os genomas. Cada diretório terá o nome das duas primeiras palavras dos arquivos fasta dos genomas. Exemplo: diretório Saccharomycops_praedatoria. Dentro de cada diretório contem um arquivo que começa com  _short_summary.specific*.txt_ . Precisamos destes arquivos. 

mkdir busco_plot

cp busco_outputs//short_summary.specific.txt busco_plot

$BUSCO/scripts/generate_plot.py -wd busco_plot/

Abaixo um exemplo deste resultado:



<img src="https://static.yanyin.tech/literature_test/protocol_io_true/protocols.io.q26g71mb1gwz/busco_figure.png" alt="" loading="lazy" title=""/>

No exemplo acima, todos os genomas apresentam boa completude, embora Barnettozyma salicaria tenha mais ortólogos ausentes. Não é necessário excluir nenhum genoma da análise. Vamos seguir para a próxima etapa.

Agora que já temos a avaliação da completude de todos os genomas, vamos identificar quais são os ortólogos de cópia única (single-copies ou 1:1) presentes nos genomas. Para isso vamos utilizar o script BUSCO_phylogenomics.py. Este script identifica proteínas BUSCO que são completas e de cópia única em todas as amostras de entrada. Alternativamente, é possível considerar os dados ausentes e optar por incluir proteínas BUSCO que sejam completas e de cópia única em uma determinada porcentagem dos genomas. Cada família BUSCO é individualmente alinhada, aparada e depois concatenada para gerar um alinhamento de supermatriz.

python ~/bin/BUSCO_phylogenomics/BUSCO_phylogenomics.py -i busco_run/ -o busco_phylo -t 48 --supermatrix --gene_tree_program iqtree
```Dentro do diretório chamado busco_phylo serão salvos os arquivos necessários para a construção da árvore filogenômica. 

Agora temos os arquivos prontos para a inferência filogenética. O arquivo de input para o iqtree2 será o SUPERMATRIX.phylip

Sugiro que seja utilizado o screen ou tmux para rodar o iqtree2.

screen iqtree2 -s SUPERMATRIX.phylip -p SUPERMATRIX.partitions.nex -m TESTMERGE --rclusterf 10 -B 1000 --sampling GENE -T AUTO

Serão gerados diversos arquivos de output. O principal arquivo será o SUPERMATRIX.partitions.nex.treefile

Este arquivo está estruturado no formato NEXUS e deve ser visualizado e editado no iTOL.