一、分子生物学试剂的科学保存条件

分子生物学试剂因成分（如蛋白质、核酸、化学物质）不同，需通过温度控制、环境调节与操作规范保障稳定性，具体保存条件分类如下：

1.1 按温度划分的保存要求

不同温度区间适配不同类型的分子生物学试剂，需根据试剂特性选择对应保存环境：

• 4℃短期保存（1-7 天）：

1. 适用试剂：短期使用的溶液类试剂（如 PCR 缓冲液、琼脂糖凝胶电泳缓冲液）、未开封的液体培养基、部分核酸染料（如 SYBR Green I）；

2. 注意事项：需放置在冰箱冷藏层，避免与易挥发试剂（如乙醇）混放，防止试剂被污染或稀释；保存时间不超过 7 天，长期使用需转移至更低温度环境。

• -20℃中期保存（1-6 个月）：

1. 适用试剂：酶类试剂（如 Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶）、配好的抗生素溶液（如氨苄青霉素、卡那霉素）、DNA/RNA 样品（如质粒、cDNA）、引物溶液（已溶解的引物）；

2. 注意事项：需放入冰箱冷冻层专用盒中，避免反复冻融（可将酶类试剂分装为 10μL / 管，单次使用一管）；液体试剂结冰后避免剧烈摇晃，防止成分破坏。

• -80℃长期保存（6 个月以上）：

1. 适用试剂：长期储存的菌种（如大肠杆菌感受态细胞）、纯化后的蛋白质样品（如抗体）、特殊消化液（如胶原酶）、珍贵核酸样品（如基因组 DNA）；

2. 注意事项：需使用专用低温冰箱，样品需密封在防漏管中，避免冰箱断电导致温度回升（可配备备用电源）；定期检查冰箱温度，确保稳定在 - 75℃至 - 85℃之间。

• 液氮（-196℃）超低温保存：

1. 适用试剂：细胞株（如 HEK293 细胞、肿瘤细胞）、组织样品（如动物肝脏组织）、需长期保持活性的生物材料；

2. 注意事项：需使用专用液氮罐，样品需放入 cryovial 冻存管并添加冻存液（如 10% DMSO），避免细胞结冰损伤；操作时需佩戴防护手套、护目镜，防止液氮冻伤。

1.2 特殊试剂的专项保存要求

部分分子生物学试剂因成分特殊，需额外注意保存细节，避免活性丧失：

• 鲎试剂（内毒素检测试剂）：

1. 冻干型鲎试剂（如 PyroSmartNextGen®）需在 2-8℃冷藏保存，禁止冷冻；复溶后需立即使用，若需短期保存，可在 - 20℃冻存（仅限一次冻融），解冻后 24 小时内用完；

2. 保存时需远离内毒素污染源（如细菌培养用品），操作时使用无内毒素的耗材（如无酶吸头、离心管）。

• 内毒素标准品（如 CSE 系列）：

1. 需在 2-8℃避光保存，禁止冷冻，防止标准品活性下降；

2. 开封后需密封保存，避免吸潮或污染，建议 1 个月内使用完毕。

• 引物粉末：

1. 需在 - 20℃密封避光保存，避免受潮或氧化；

2. 未溶解的引物粉末有效期为 6 个月，溶解后需在 - 20℃保存，建议 1 个月内使用，避免降解。

1.3 保存环境的辅助控制

• 避光干燥：

1. 光敏试剂（如紫外吸收染料、部分酶类）需放入棕色试剂瓶或避光盒中，避免强光照射（如阳光、紫外灯）；

2. 易吸潮试剂（如干燥培养基、引物粉末）需在干燥环境中保存，可在试剂柜中放置干燥剂（如硅胶干燥剂），定期更换。

• 通风防腐蚀：

1. 有毒或腐蚀性试剂（如汞盐、浓硫酸、酚氯仿）需单独存放在通风柜中，贴好警示标签（如 “有毒”“腐蚀性”）；

2. 易挥发试剂（如乙醇、甲醇）需密封保存，避免与其他试剂混放，防止试剂间相互作用。

二、如何判断分子生物学试剂是否失效

分子生物学试剂失效会导致实验结果异常（如 PCR 无扩增、蛋白质检测无信号），需通过物理检查、功能验证、性能测试等多维度判断，具体方法如下：

2.1 基础物理检查：直观判断试剂状态

• 外观观察：

1. 溶液类试剂（如 PCR 缓冲液、酶溶液）若出现变色（如从无色变为黄色、棕色）、沉淀（如酶溶液出现絮状物）、浑浊（如培养基出现浑浊），表明试剂可能已失效；

2. 粉末类试剂（如干燥培养基、引物粉末）若出现结块、吸潮（如粉末粘连在管壁），可能因受潮导致成分破坏，建议停止使用。

• 气味检查：

1. 部分含硫化合物、含氮试剂（如某些氨基酸试剂）变质后会产生异味（如臭味、酸味），若闻到异常气味，需立即停止使用并妥善处理；

2. 操作时需在通风处进行，避免直接闻试剂气味，可轻轻扇动瓶口闻少量气味。

2.2 功能验证：通过实验检测试剂活性

• 空白对照测试：

1. 以去离子水为样本，按照试剂说明书进行实验，检测试剂空白值，若结果不符合说明书要求，表明试剂失效；

2. 示例：HBDH（α- 羟丁酸脱氢酶）试剂的空白吸光度需≥11000，若检测结果为 9000，低于标准值，说明试剂活性下降或失效。

• 反应曲线分析：

1. 使用仪器（如酶标仪、qPCR 仪）监测试剂反应过程，若反应曲线异常（如无上升趋势、平台期吸光度过低），表明试剂无活性；

2. 示例：qPCR 试剂的扩增曲线若始终处于基线水平，无明显指数增长期，说明 Taq DNA 聚合酶失效或引物降解。

2.3 性能测试：通过标准品与对照验证

• 标准品验证：

1. 使用已知浓度的标准品（如 DNA 标准品、蛋白质标准品）进行实验，若检测结果与预期偏差超过 10%，可能因试剂失效或污染；

2. 示例：qPCR 实验中，使用 1000 拷贝 /μL 的 DNA 标准品，若检测结果为 700 拷贝 /μL，偏差达 30%，且重复实验结果一致，说明 qPCR 试剂失效。

• 阳性对照实验：

1. 使用已知有效的阳性对照（如阳性细胞、阳性质粒）进行实验，若结果不符合预期，排除操作误差后，可判断试剂失效；

2. 示例：siRNA 转染试剂实验中，用荧光标记的阴性对照 siRNA 转染细胞，若荧光强度正常但目标基因沉默效率低于 30%（预期≥50%），说明转染试剂释放 siRNA 的效率下降，已失效。

2.4 环境与储存追溯：排查保存问题

• 储存条件核对：

1. 若试剂曾暴露于高温（如 - 20℃保存的酶类试剂被误放入 4℃超过 24 小时）、强光（如光敏试剂未避光保存）或潮湿环境（如未密封的干燥培养基），即使外观无异常，也可能已失效；

2. 示例：未密封的引物粉末在潮湿环境中放置 3 天，虽外观无明显变化，但溶解后进行 PCR 实验无扩增产物，说明引物已降解。

• 有效期核对：

1. 超过保质期的分子生物学试剂需谨慎使用，即使外观正常，也需通过标准品验证活性；

2. 示例：过期 1 个月的 Taq DNA 聚合酶，通过 PCR 实验检测，发现扩增效率比新鲜试剂下降 50%，需更换新试剂。

2.5 替代排除法：定位多组分试剂失效问题

对于多组分分子生物学试剂（如双试剂系统、试剂盒），可通过分步替换定位失效组分：

• 以 HBDH 双试剂（试剂 1 和试剂 2）为例：

1. 步：用已知有效的试剂 1 与待检测的试剂 2 混合，进行空白对照测试，若结果异常，说明试剂 2 失效；

2. 第二步：用已知有效的试剂 2 与待检测的试剂 1 混合，再次测试，若结果异常，说明试剂 1 失效；

3. 第三步：若两步测试结果均异常，需同时更换试剂 1 和试剂 2。

三、数据支撑案例：某实验室分子生物学试剂失效的排查与解决

某科研实验室在进行 qPCR 实验时，多次出现无扩增产物的情况，通过系统排查，发现是分子生物学试剂（qPCR 混合液）失效导致，具体过程如下：

3.1 问题背景

• 实验目的：检测肿瘤细胞中某基因的表达水平，使用 qPCR 技术；

• 异常现象：连续 3 次实验中，所有样品（包括阳性对照）均无扩增曲线，Ct 值显示 “Undetected”；

• 初步排查：排除操作误差（如加样错误、仪器故障），怀疑 qPCR 混合液失效。

3.2 失效判断过程

• 物理检查：观察 qPCR 混合液外观，为无色透明液体，无沉淀、变色，外观无异常；核对有效期，仍在保质期内（距过期还有 2 个月）；

• 功能验证：

1. 空白对照测试：用去离子水代替模板，进行 qPCR 反应，空白吸光度为 0.02（说明书要求≤0.05），符合标准；

2. 反应曲线分析：监测反应过程，发现所有样品的荧光信号始终处于基线水平，无指数增长期，说明试剂无活性；

• 储存条件追溯：询问实验室人员，发现该 qPCR 混合液曾被误放入 4℃冰箱冷藏 3 天（正确保存条件为 - 20℃），判断因温度异常导致酶活性丧失。

3.3 解决与优化措施

• 试剂更换：使用新批次的 qPCR 混合液重新实验，阳性对照 Ct 值为 22.5（正常范围 20-25），样品均出现正常扩增曲线，实验恢复正常；

• 储存优化：在 - 20℃冰箱中划分试剂存放区域，贴好 “分子生物学试剂 - 20℃专用” 标签；对易混淆的试剂（如 qPCR 混合液、反转录试剂）进行颜色标记，避免误拿；

• 记录管理：建立试剂储存台账，记录试剂名称、开封时间、保存条件，定期检查（每周 1 次），确保储存合规。

四、分子生物学试剂使用的常见问题与 FAQ

4.1 FAQ 问答段落

Q1：酶类分子生物学试剂（如限制性内切酶）反复冻融会导致失效吗？为什么？

会导致失效，原因如下：一是酶类试剂的核心成分是蛋白质（如限制性内切酶的活性中心为氨基酸序列），反复冻融会导致蛋白质结构破坏（如氢键断裂、空间构象改变），从而丧失催化活性；二是冻融过程中，试剂中的水分会形成冰晶，冰晶膨胀可能破坏酶分子的完整性；三是反复冻融还可能导致试剂中的缓冲液成分（如盐类）浓度不均，影响酶的反应环境。建议将酶类试剂分装为单次使用的小体积（如 5μL / 管），冻存后一次性用完，避免反复冻融，若需临时使用，可在冰盒中放置（4℃），2 小时内用完。

Q2：未开封的分子生物学试剂超过保质期，是否一定不能使用？如何判断？

不一定完全不能使用，但需通过严格验证确认活性，具体步骤如下：一是物理检查，观察试剂外观（如溶液是否澄清、粉末是否结块），若外观异常，直接丢弃；二是功能验证，用空白对照测试试剂的基础活性（如酶类试剂检测催化效率、qPCR 试剂检测空白吸光度），若符合说明书要求，继续下一步；三是标准品验证，使用已知浓度的标准品进行实验，若检测结果与预期偏差≤10%，说明试剂仍可使用（仅限非关键实验，如预实验）；四是阳性对照验证，通过阳性样品检测试剂的特异性与灵敏度，若结果正常，可用于常规实验，若偏差较大，需更换新试剂。需注意：超过保质期 1 年以上的试剂，即使验证合格，也不建议用于关键实验（如临床样本检测、发表论文的数据采集）。

Q3：粉末状分子生物学试剂（如引物粉末）开封后吸潮结块，还能继续使用吗？

不建议继续使用，原因如下：一是粉末吸潮后，可能发生化学变化（如引物粉末中的碱基氧化、培养基中的成分水解），导致活性下降或失效；二是吸潮结块的粉末难以完全溶解，溶解后可能出现浑浊或沉淀，影响实验结果（如引物浓度不均导致 PCR 扩增效率下降）；三是吸潮过程中可能引入杂质或微生物（如培养基吸潮后易滋生细菌），导致实验污染。若已吸潮，可尝试少量溶解（如取 10% 粉末溶解），通过琼脂糖凝胶电泳（检测引物）或无菌测试（检测培养基）验证，但为确保实验准确性，建议更换新的未吸潮试剂。

Q4：如何正确分装分子生物学试剂（如抗生素溶液），避免污染与失效？

正确分装需遵循 “无菌、密封、标记” 三大原则，步骤如下：一是分装前准备，使用无菌的离心管（提前灭菌）、无酶吸头，在超净工作台或生物安全柜中操作，避免环境污染；二是分装操作，将试剂缓慢倒入离心管，避免液体溅出（如抗生素溶液），每管分装量为单次使用量（如 50μL / 管），避免分装后反复冻融；三是密封与标记，用 parafilm 密封离心管盖子（防止挥发），贴上标签，注明试剂名称、浓度、分装日期、保存条件（如 “氨苄青霉素 - 100mg/mL-2025.05.10-20℃保存”）；四是冻存，分装后立即放入对应温度的冰箱（如 - 20℃），避免室温放置时间过长（不超过 30 分钟），确保试剂活性。