一、分子生物学实验的主要类型（含 2 个带项目符号列表）

分子生物学实验有哪些？从研究对象与目的出发，可分为核酸操作、蛋白质分析、基因编辑等六大类，每类实验均有明确的应用场景与技术标准：

1.1 核酸扩增与检测实验

基础扩增实验：

PCR（聚合酶链式反应）：通过变性 - 退火 - 延伸循环，体外扩增特定 DNA 片段，适用于基因克隆模板制备、病原体诊断（如 HIV、HBV 检测），某实验室用其扩增新冠病毒 ORF1ab 基因，检出率达 99%；

实时荧光定量 PCR（qPCR）：结合荧光探针或染料，定量分析目标 DNA/RNA 浓度，用于基因表达差异分析、病原体载量检测（如乙肝病毒 DNA 定量），实验误差可控制在 ±5% 以内。

核酸分离与鉴定实验：

DNA/RNA 提取实验：从细胞、组织中分离核酸，RNA 提取需使用 RNase-free 耗材与 DEPC 水，避免降解；

琼脂糖凝胶电泳实验：分离不同大小的 DNA/RNA 片段，通过与 Marker 对比判断核酸纯度与浓度，是 PCR、酶切实验的基础验证步骤。

1.2 分子克隆与载体构建实验

核心操作实验：

限制性内切酶消化实验：使用限制性内切酶（如 EcoRⅠ、BamHⅠ）切割 DNA，获取目的片段，需严格控制酶用量（通常 1U/μg DNA）与反应温度（37℃恒温）；

质粒提取与转化实验：从大肠杆菌中提取重组质粒，通过氯化钙法制备感受态细胞，将外源 DNA 导入细胞，转化率可达 10⁶-10⁸ CFU/μg DNA；

连接与筛选实验：用 T4 DNA 连接酶连接目的片段与载体，通过蓝白斑筛选、抗生素抗性筛选阳性克隆，后续需 Sanger 测序验证序列准确性。

1.3 蛋白质分析与互作实验

蛋白检测实验：

Western Blot 实验：通过 SDS-PAGE 电泳分离蛋白质，转膜后用特异性抗体检测目标蛋白表达，适用于蛋白表达量变化分析，某科研团队用其验证肿瘤细胞中 EGFR 蛋白的表达差异；

ELISA 实验：酶联免疫吸附实验，定量检测蛋白质浓度，常用于疾病诊断（如乙肝表面抗原检测）与蛋白表达定量，灵敏度可达 ng/mL 级别。

蛋白互作实验：

GST pull-down 实验：利用谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白，捕获细胞内与其相互作用的蛋白，用于验证蛋白质间的直接结合；

荧光共振能量转移（FRET）实验：通过荧光基团间的能量转移，实时监测活细胞内蛋白质间的动态相互作用，分辨率可达 10nm 以内。

1.4 基因表达与调控实验

表达分析实验：

外源基因诱导表达实验：在大肠杆菌、酵母等宿主中诱导目标蛋白表达，通过 IPTG 诱导剂调控表达强度，后续用 SDS-PAGE 检测表达效果；

染色质免疫沉淀（ChIP）实验：研究蛋白质与 DNA 的相互作用（如转录因子结合启动子），通过抗体沉淀目标蛋白 - DNA 复合物，后续用 qPCR 或测序分析结合位点。

1.5 基因组与高通量实验

测序实验：

Sanger 测序实验：双脱氧链终止法测定 DNA 序列，适用于单基因测序、克隆验证，准确率达 99.99%；

高通量测序（NGS）实验：如 Illumina 测序，一次性检测多个基因或全基因组，用于基因突变筛查、转录组分析，某医院用其检测肿瘤患者 500 个相关基因，突变检出率达 98%。

芯片实验：

基因芯片实验：高通量分析基因表达或 SNP 分型，可同时检测上万条基因的表达变化，适用于疾病分型与药物筛选。

1.6 基因编辑实验

CRISPR-Cas9 实验：

设计特异性 sgRNA，构建基因编辑载体，转染目标细胞；

通过流式细胞术筛选阳性细胞，后续用测序验证基因编辑效果，适用于基因敲除、敲入实验，某实验室用其构建肺癌细胞 EGFR 基因敲除模型，成功率达 80%。

二、分子生物学实验的常见误区及解决方案

在开展分子生物学实验有哪些相关操作时，易因操作不当、设计缺陷导致结果不可靠，以下是常见误区及应对策略：

2.1 RNA 质量与污染问题

误区：RNA 降解或混入 DNA、RNase，导致 qPCR、Northern Blot 结果偏差；

解决方案：

全程使用 RNase-free 枪头、离心管与 DEPC 水，操作时戴无粉手套、口罩，避免唾液污染；

通过琼脂糖凝胶电泳观察 RNA 的 28S、18S 条带（完整 RNA 的 28S/18S 亮度比约 2:1），或用生物分析仪检测 RNA 完整性（RIN 值≥7.0）；

提取 RNA 时，使用双层枪头吸取 TRIzol 分层中的水相，避免吸入下层 DNA 与蛋白，减少污染。

2.2 qPCR 实验设计与操作误区

误区：未设置对照、预混液配制不均，导致扩增效率波动（±10%-15%），结果不可重复；

解决方案：

配制预混液时，先制备母液（含酶、引物、染料、水），充分混匀后再分装至反应孔，避免逐孔移液误差；

必须设置无模板对照（NTC，检测污染）、无逆转录对照（NRT，检测 DNA 污染）及阳性 / 阴性对照（验证扩增体系）；

调整荧光阈值至扩增曲线的指数增长期，确保 Cq 值准确，扩增效率控制在 90%-110% 之间。

2.3 移液操作与样本处理误区

误区：腐蚀性液体（如丙酮、强酸）或高粘度液体（如甘油）腐蚀塑料吸头，导致体积不准或样本污染；

解决方案：

处理腐蚀性液体时使用玻璃或金属移液器，避免塑料吸头变形；

超痕量分析（如 pg 级核酸检测）时，选择无金属离子污染的低吸附吸头，减少样本损失；

样本保存时，RNA 提取后立即反转录为 cDNA，或在 - 80℃保存于 TRIzol 中；蛋白样本添加蛋白酶抑制剂，避免反复冻融导致变性。

2.4 Western Blot 与 qPCR 结果矛盾误区

误区：基因表达（mRNA，qPCR 检测）与蛋白表达（Western Blot 检测）因转录 - 翻译时间差、技术差异出现不一致；

解决方案：

验证内参稳定性：Western Blot 使用 β-actin 与 GAPDH 双内参，qPCR 选择 2-3 个管家基因（如 GAPDH、β-actin、18S rRNA），避免单一内参误差；

控制实验时间节点：若研究药物处理后的表达变化，需同时检测 mRNA 与蛋白的动态变化（如处理后 6h、12h、24h），避免时间差导致的矛盾；

重复验证：同一实验至少重复 3 次，结合统计学分析（如 t 检验、方差分析）判断结果可靠性。

三、经典分子生物学实验案例（数据支撑）

某科研团队在开展 “肺癌细胞 EGFR 基因功能研究” 时，通过系列分子生物学实验有哪些的组合应用，明确了 EGFR 基因对肿瘤细胞增殖的影响，具体实施与效果如下：

3.1 实验背景

研究目标：验证 EGFR 基因敲除对肺癌 A549 细胞增殖的抑制作用；

核心实验需求：通过基因编辑、qPCR、Western Blot、细胞增殖实验，形成 “基因 - 蛋白 - 功能” 的完整验证链。

3.2 实验流程（含分子生物学实验组合）

CRISPR-Cas9 基因编辑实验：

设计 EGFR 基因特异性 sgRNA，构建 pSpCas9 载体，转染 A549 细胞；

通过嘌呤霉素筛选阳性细胞，Sanger 测序验证基因敲除效果，成功构建 EGFR 敲除细胞株（敲除效率 80%）。

qPCR 实验：

提取野生型与敲除型细胞的 RNA，反转录为 cDNA；

检测 EGFR 基因 mRNA 表达量，结果显示敲除组 EGFR mRNA 表达量较野生型降低 92%（n=3，P<0.01）。

Western Blot 实验：

提取细胞总蛋白，检测 EGFR 蛋白表达，敲除组 EGFR 蛋白几乎无表达，内参 β-actin 表达稳定；

CCK-8 细胞增殖实验：

检测两组细胞在 0h、24h、48h、72h 的增殖活性，敲除组细胞增殖率较野生型降低 65%（n=5，P<0.01）。

3.3 实验结论与价值

通过 “CRISPR-Cas9→qPCR→Western Blot→CCK-8” 的分子生物学实验有哪些的组合应用，明确了 EGFR 基因对肺癌 A549 细胞增殖的关键作用；

实验结果为后续 EGFR 靶向药物研发提供了细胞模型支撑，相关成果发表于 SCI 期刊（影响因子 5.1），实验重复性经 3 次独立验证均达 90% 以上。

四、FAQ 问答段落

Q1：分子生物学实验有哪些核心分类？新手入门应先掌握哪些基础实验？

A1：分子生物学实验有哪些核心分类可概括为六大类：核酸扩增与检测（如 PCR、qPCR）、分子克隆与载体构建（如酶切、连接）、蛋白质分析与互作（如 Western Blot、GST pull-down）、基因表达与调控（如 ChIP、RT-PCR）、基因组与高通量实验（如 NGS、基因芯片）、基因编辑实验（如 CRISPR-Cas9）。新手入门建议先掌握基础实验：PCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳、DNA/RNA 提取、Western Blot，这些是后续复杂实验的基础，且操作相对标准化，易上手。

Q2：开展分子生物学实验时，如何避免 RNA 降解这一常见问题？

A2：避免 RNA 降解需全程控制 RNase 污染：一是实验前用 RNase 清除剂擦拭台面、移液器，使用 RNase-free 枪头、离心管与 DEPC 水（经 121℃高压灭菌）；二是操作时戴无粉手套、口罩，避免说话产生的唾液污染，且手套需频繁更换（每接触非无菌物品后更换）；三是 RNA 提取后立即使用（如反转录为 cDNA），若需保存，需在 - 80℃保存于 TRIzol 或 RNA 保存液中，避免反复冻融，同时可添加 RNase 抑制剂延长保存时间。

Q3：qPCR 实验中，设置多种对照的目的是什么？哪些对照是必须设置的？

A3：qPCR 设置对照是为了排除污染、验证体系可靠性，确保结果真实。必须设置的对照包括：无模板对照（NTC，仅含预混液与引物，无模板 DNA/RNA，检测是否存在体系污染）、无逆转录对照（NRT，仅含 RNA 模板与引物，无逆转录酶，检测 RNA 中是否混入 DNA）、阳性对照（含已知阳性模板，验证扩增体系是否有效）、阴性对照（含已知阴性模板，验证引物特异性）。通过这些对照，可排除假阳性、假阴性结果，确保数据可靠。

Q4：Western Blot 实验中，条带模糊或无信号的常见原因是什么？如何解决？

A4：常见原因及解决方案：一是转膜效率低，需确认转膜时间（根据蛋白分子量调整，如 50kDa 蛋白转膜 90 分钟）、电流（300mA 恒流），转膜后用丽春红染色验证蛋白是否转移到膜上；二是抗体特异性差或效价低，需选择经过验证的特异性一抗，使用前按说明书稀释（通常 1:1000-1:5000），二抗选择与一抗匹配的种属来源；三是封闭不充分，导致非特异性结合，需使用 5% 脱脂牛奶或 BSA 封闭 1-2 小时（根据蛋白特性选择，磷酸化蛋白建议用 BSA）；四是蛋白上样量不足，可适当增加上样量（如从 20μg 增至 50μg），同时确保蛋白提取充分（使用合适的裂解缓冲液，如膜蛋白用含去垢剂的缓冲液）。