使用光片显微镜进行人类早期大脑类器官发育的形态动力学研究

图2.稀疏和多位点荧光标记脑类器官的长期活体成像.f、4 个不同类器官（第 15 天）的 3D 投影（左）和横截面（右），用全切片荧光原位杂交链反应（HCR）染色标记转录本。比例，100 微米。g) 从 188 小时成像实验中 75 小时成像的最大投影图像。类器官包含 5 种不同的细胞系，这些细胞系具有稳定的蛋白质遗传标记，使用红色或绿色荧光蛋白（RFP，GFP），以及未标记的细胞。比例，100 微米。h) 组织器切片（84 小时）显示核膜（Lamin，RFP，品红色）、质膜标记（CAAX，RFP，品红色）、肌动蛋白（GFP，绿色）、微管蛋白（RFP，品红色）和细胞核（组蛋白，GFP，绿色）。i) 不同时间点的图像显示最大强度投影（左半部分）和切片（右半部分）。

每两天更换一次培养基。成像使用 Viventis LS1 Live 光片显微镜进行，具体设置如下：

• 物镜——25X NA1.1水镜
• 成像视野——710μm
• xy 像素大小——0.347μm
• Z轴步径——2μm，201 步
• ​采集帧率为——30 分钟 

 

图4. 使用接多路多位点细胞标签的细胞和细胞核形态转变。a)分析策略示意图。b) 第 6 天的类器官最大强度投影，标记有核膜（Lamin，RFP，粉色）、质膜（CAAX，RFP，粉色）、肌动蛋白（GFP，绿色）、微管蛋白（RFP，粉色）和细胞核（组蛋白，GFP，绿色）c) 解通道图像（Lamin，深棕色；CAAX，橙色；肌动蛋白，蓝色；微管蛋白，品红色；组蛋白，绿色） d) 基于形态特征提取的所有解多通道标签的 PAGA 初始化 UMAP 嵌入。e) PAGA 初始化 UMAP 嵌入显示肌动蛋白、微管蛋白和 CAAX 标签的轴长变化，以及使用组蛋白和 Lamin 分割测量的细胞核体积变化。PAGA 图显示平均簇年龄（天数）的变化，节点大小表示一个簇内的细胞数量，边宽反映两个簇之间的连接强度。f) 在 matrigel 条件下，所有细胞（肌动蛋白）按其对齐指数（与最近的类器官表面法线的绝对余弦角）着色。比例范围为 0-1，其中 1（红色）对应于与类器官表面垂直对齐的细胞。g) PAGA 初始化的 UMAP 嵌入和 PAGA 图显示使用从基质胶、无基质和琼脂糖条件下分割的细胞的细胞形态类型聚类。图基于提取的所有分割细胞（肌动蛋白）的形态测量。h) PAGA 初始化的 UMAP 嵌入显示细胞轴比随时间变化，并叠加显示使用 PAGA 图的平均聚类年龄。PAGA 图根据聚类的平均年龄从浅灰色到黑色进行颜色编码。i) 每个形态类型聚类的示例细胞（肌动蛋白）。j) 显示标记有肌动蛋白的细胞的类器官示例图像，显示按其形态类型聚类着色的细胞。k) 堆叠条形图显示在基质胶、无基质和琼脂糖条件下各个肌动蛋白形态类型聚类中细胞的比例。l) 图像显示在第 6 天基质胶条件下的细胞（肌动蛋白）根据细胞对齐指数着色，以及在第 9 天无基质和琼脂糖条件下的细胞。m) 小提琴图显示在第 4 天到第 12 天所有三种条件下所有分割细胞的细胞对齐（肌动蛋白）值。n) 线图显示在三种条件下香农指数的变化，基于随时间变化的每个簇的细胞数量（基质胶 (n=3)、无基质 (n=3) 和琼脂糖 (n=3)）。

矩阵通过调节 WNT 通路影响类器官的
形态发生和模式形成

为了理解在不同基质条件（基质胶、琼脂糖、无矩阵）下生长的类器官中发展出的分子细胞状态，我们对第 13 天的类器官进行了单细胞转录组分析，差异表达基因的基因本体分析显示出多个信号通路的富集，包括WNT、Notch、FGF 和 Hippo 信号通路以及与肌动蛋白细胞骨架调节相关的基因。

基质胶诱导的神经外胚层的强烈形态变化，以及在无基质条件下 WNT 和 Hippo 信号通路的上调，测试了YAP调节对类器官发育的影响。综合证实了我们应用含有外部基底膜丰富的 ECM 的 matrigel，导致腔体扩张并自我模式化为主要的头侧前脑区域，并且 YAP1 的激活和 WLS 表达水平的增加促进了发育中的神经上皮的尾部化。