表观转录组之m6A甲基化修饰介绍

m6A(N6-Methyladenosine)甲基化修饰已成为近年来科研圈的“明星”（通过Pubmed检索"m6A"关键词，可以看出近10年内m6A的文章逐年增长，作为表观转录组中最丰富的化学修饰之一，m6A在多种生理过程中发挥着调控基因表达的关键作用。在了解m6A甲基化修饰之前，我们先了解一下什么是表观转录组。

表观转录组表观转录组（Epitranscriptome）指RNA分子上所有可逆化学修饰的集合，这些修饰不改变RNA序列，但可以通过调控基因表达（如翻译、降解、剪接等）发挥作用。RNA修饰广泛存在于各种RNA类型中，包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、miRNA、siRNA、piRNA和lncRNA等。目前已知的 RNA修饰超过150种，常见类型包括甲基化（如m6A、m5C）、羟基化、假尿苷化（Ψ）等。其中RNA甲基化是最常见的修饰类型之一，在mRNA、tRNA等分子中占比较高（如哺乳动物 mRNA 中 m6A 修饰可占甲基化修饰的 80% 以上）。RNA甲基化，是指在甲基转移酶（如 METTL 家族、CMTR 家族等）的催化下，将甲基基团（-CH3）通过共价键连接到RNA分子中核苷酸的特定原子上的修饰过程。RNA 甲基化修饰存在多种类型，包括 m6A、m5C、m1A、m7G 等。

m6A甲基化修饰m6A甲基化修饰即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子（N6位）上的甲基化修饰。m6A甲基化修饰是真核生物mRNA最普遍的内部修饰之一，约占到mRNA甲基化修饰的80%。m6A在调控基因表达（如调节mRNA可变剪切、稳定性、降解速率及翻译效率等）中起着重要作用。

m6A修饰主要发生在RRACH（R = G或A，H = A、C或U ）这类motif上，这类motif主要在mRNA的终止密码子和3’UTR处富集，即m6A主要发生在终止密码子和3’UTR附近。研究表明，m6A最主要的功能是调控mRNA稳定性：在胞质中，m6A修饰可被阅读器蛋白YTHDF2识别，通过招募相关因子将mRNA富集至Processing body（P-body），从而加速其降解。此外，m6A修饰可通过改变RNA局部二级结构（如茎环结构），暴露或遮蔽microRNA的结合位点，进而调控microRNA介导的mRNA降解效率。在核内，m6A修饰被核内阅读器YTHDC1识别后，可通过招募剪接因子（如SRSF家族蛋白）调控RNA可变剪接，并与核输出受体NXF1互作促进mRNA出核，最终实现基因表达调控。值得注意的是，m6A与DNA甲基化之间存在双向互作网络，例如m6A甲基转移酶METTL3可通过稳定DNA甲基转移酶DNMT3A的mRNA，间接增强基因组DNA甲基化水平，而DNA甲基化状态也可通过表观遗传调控影响m6A相关酶的转录。☟ 下图展示了目前已知的部分m6A的生物功能。

m6A的调控机制：m6A甲基化修饰是动态可逆的生物过程，这种动态变化依赖于多种功能的酶进行调节，主要包括三种类型：甲基转移酶(Methyltransferases)、去甲基化酶(Demethylases)以及甲基化识别蛋白(Binding proteins)。甲基转移酶（Writers）也称为 “写入器”，负责催化 mRNA 等 RNA 分子的碱基发生 m6A 甲基化修饰。核心成员包括METTL3/METTL14 复合物（催化 m6A 的直接添加），以及辅助因子WTAP、VIRMA、KIAA1429等（参与酶复合物定位或底物识别），此外还包括METTL16、RBM15/15B、ZC3H3、CBLL1等具有特定生物学功能的甲基转移酶。去甲基化酶（Erasers）也称为 “擦除器”，负责催化 m6A 修饰的去除。目前已知的 m6A 去甲基化酶包括FTO和ALKBH5，可特异性移除 mRNA 中的甲基基团，实现修饰的动态调控。m6A 识别蛋白（Readers）也称为 “阅读器”，通过特异性结构域识别m6A修饰的RNA，招募下游效应因子或改变RNA构象，从而调控mRNA的稳定性、剪接、翻译等过程。主要分为两类：1、含YTH结构域的蛋白：• 胞质型：YTHDF1（促进翻译）、YTHDF2（介导mRNA降解）、YTHDF3（协同前两者功能）；• 核内型：YTHDC1（调控剪接和出核）、YTHDC2（参与翻译起始）。2、非YTH结构域的蛋白：• IGF2BP1/2/3（通过m6A修饰增强mRNA稳定性）；• HNRNPA2B1（识别m6A并调控靶基因的选择性剪接）。不同物种中，m6A 阅读器的功能存在特异性：例如，高海拔哺乳动物通过YTHDF1 识别缺氧相关基因（如 HIF-1α）mRNA 的 m6A 修饰，增强其翻译效率，从而抵抗缺氧诱导的细胞凋亡，体现了表观调控对环境适应的重要性。

M6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术m6A修饰早在1970年代通过放射性标记技术被发现，而其在转录组中的全基因组分布特征最早通过二代测序（NGS）技术揭示。研究表明，在哺乳动物中，约25%的mRNA分子含有m6A修饰，平均每个转录本携带1-3个修饰位点，主要分布于终止密码子附近及3'UTR区域。甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq/m6A-seq）通过特异性抗体富集含m6A的RNA片段，结合高通量测序可定位到约100 nt分辨率的修饰区域，已广泛用于m6A修饰的检测。MeRIP-seq/m6A-seq技术原理为通过特异识别m6A修饰的抗体，对细胞内具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀。对沉淀下来的RNA片段进行高通量测序，结合生物信息学分析，即可在全基因组范围内系统解析m6A修饰的分布特征、富集序列模式及潜在调控功能。该技术是目前研究 m6A 修饰最广泛使用的方法之一，已被应用于揭示m6A在发育、疾病等过程中的动态调控机制。

MeRIP-seq是基于免疫沉淀富集技术，该技术包括IP和input两个文库：IP文库是通过m6A特异性抗体富集含甲基化修饰的RNA片段，用于检测m6A修饰的分布；Input文库为未进行免疫沉淀的RNA样本（处理流程与IP一致），作为对照用于排除非特异性结合。 通过比较IP与Input文库的测序信号，可绘制全基因组范围内的m6A修饰图谱，单独的input文库可视为RNA-seq文库，可用于进行表达图谱的分析。文库构建原理图如下：

今天为大家介绍的内容以基础知识为主，旨在为大家筑牢理论根基，希望能对大家有所助益。后续我们将为大家分享m6A的应用实例，敬请期待！