如何提高准确性、提高效率和减少错误。

分子克隆技术彻底改变了生物学研究和医学领域。20世纪50年代至60年代，多种细菌酶的发现与分离，特别是限制性内切酶的发现，推动了分子克隆技术的起步。此后，聚合酶链式反应（PCR）等创新技术的进一步发展，对技术方法及其应用的进步做出了巨大贡献。

如今，研究人员可以利用多种专门的克隆技术，这些技术拥有广泛的应用。分子克隆的应用包括：

• 研究基因与蛋白质的功能及表达

• 临床应用，包括治疗疾病疗法的靶点发现及改进疫苗的研发

• 转基因生物的生成

什么是分子克隆？

分子克隆是指捕获并分离一个特定的核酸片段（称为插入片段），使其能够在原本的基因组以外中扩增的过程。

分子克隆的一般流程如下图（图1）所示。首先，使用限制性内切酶对DNA克隆载体/质粒（以蓝色表示）和含有目标DNA片段（以红色表示）的基因组（以灰色表示）进行切割，从而释放出该DNA片段。随后，这一片段可以被引入（连接）到DNA载体中。包含DNA片段的DNA载体称为“重组分子”（或重组DNA）。此重组分子可被转入能够大量复制重组DNA的细菌宿主中。

图1.重组DNA

DNA载体的特点

最常见的DNA载体类型是细菌质粒，这是一种独立于细菌染色体之外、在细菌中生长的小型环状DNA片段。目前常用于克隆的质粒上具有一些能够提高克隆效率的特征片段。

• 质粒图中沿质粒边缘标示了多个限制性位点（例如，EcoRI）。限制性内切酶能够识别这些限制性位点并在这些位置切割DNA。对于一些特定的克隆方法，限制性内切酶的切割是必要的步骤。

• 大肠杆菌（E. coli）复制起点，或称“ori”（黄色），使得质粒能够利用大肠杆菌的DNA复制机制独立于细菌基因组进行复制。

• 抗生素抗性基因。以pBR322质粒为例，其上携带有氨苄青霉素和四环素抗性基因（绿色箭头）及相应的启动子（白色箭头）。这些抗性基因使得我们能够对质粒进行筛选。在细菌培养环境中添加相应的抗生素时，抗性基因的表达能够保护细菌，而不携带该质粒的细菌则会死亡，这些抗性基因也被称为选择标记。选择标记的类型取决于质粒所针对的宿主生物体。

图2.大肠杆菌质粒pBR322图谱

多克隆位点（Multiple Cloning Site, MCS）是一个包含多个限制性酶切位点的多聚接头能够在保护质粒中关键元件不受影响的情况下更灵活地向质粒中插入DNA片段，简化克隆的过程。例如，在pUC19质粒中，以蓝色标识的MCS（图3），包含一系列可供该质粒克隆时使用的限制性内切酶位点。

图3.pUC19中的限制性内切酶识别位点

科研人员采用不同的生物体样本进行生物学研究，这些生物包括小鼠、斑马鱼、青蛙和酵母等。由于每种生物的生物学特性存在显著差异，因此需要特定且专用的质粒来完成在每个独特生物体中的克隆和研究工作。换言之，每种生物体样本都需要使用含有特定元件的载体，这些元件能够让载体在该样本生物体内进行复制以及基因表达

质粒克隆周期

如质粒克隆周期图中所示，克隆涉及多个实验步骤。

图4.质粒克隆周期

步骤1：DNA的操作

第一步是对DNA进行操作，以生成一个新的重组DNA分子，包括将目的DNA片段插入到克隆载体中。对质粒进行操作、分离目的片段的经典方法是使用限制性内切酶。

用限制性内切酶切割后的质粒会变为线性。当质粒和DNA片段被同一种限制性内切酶切割后，可以使用一种名为DNA连接酶的酶将它们重新连接起来。连接酶像“胶水”一样，将DNA片段与线性化的质粒粘合在一起，形成一个重组载体——一个功能性的环状质粒。

图5.使用限制性内切酶切割后插入

步骤2：转化

接下来，通过转化过程将重组DNA导入细菌细胞，使细菌能够复制重组DNA。

细菌由于能够从环境中获取遗传物质而成为了一种良好的克隆载体。科学家优化了这一过程以促进克隆实验的进行。目前实验室中最常用的转化技术是利用化学感受态细胞，这些细胞经过氯化钙处理，使得质粒DNA能够附着在细胞膜上。另一种技术是电穿孔法，该方法会将细胞暴露于电场（电击）中，增加了细胞膜的通透性，从而使质粒得以进入细胞。

无论是采用化学转化还是电穿孔技术，都只有极小比例的细胞会在诱导下吸收周围环境中的DNA。

图6.质粒转化

步骤3：筛选与鉴定

将质粒导入感受态细菌后，经过短暂复苏再接种到琼脂平板上以便其生长和扩增。经过适当筛选之后，只有成功转化并携带有环状质粒的细胞才能够生长。

这种选择性生长通常是由于质粒中含有的抗生素抗性基因，当该基因表达时，能够使细菌在含有抗生素的培养基中生长。

克隆过程中可产生三种类型的质粒：

1. 载体自身重新连接（无插入片段的质粒）。

2. 不含目的DNA片段的片段连接到载体上（带有错误插入片段的质粒）。

3. 目的DNA片段连接到载体上（带有正确插入片段的质粒）。

所有这些质粒都能在含有抗生素的条件下促进细菌的生长。接下来的步骤是通过蓝白斑筛选来确定哪些克隆含有正确的插入片段。

蓝白斑筛选是一种常见的筛选技术，根据是否存在质粒，细菌会呈现蓝色或白色。这是由于质粒含有一种特殊的编码序列——LacZα。当LacZα在多克隆位点（MCS）处被克隆操作打断时，β-半乳糖苷酶不能产生，细菌就会呈现白色而非蓝色。

图7.质粒琼脂平板

步骤4：从细菌中提取

一旦候选克隆确定后，就可以接种少量的细菌培养物，以便提取DNA进行分析。接着，通过DNA小量提取方法（DNA mini-prep），快速制备少量的质粒DNA。目前，市面上有许多DNA小量提取试剂盒可供使用。

步骤5：克隆验证

DNA分离后，必须验证哪些克隆是所需的。有多种方法可以确定哪些克隆是正确的：

• 测序最为准确方法，通过将克隆序列与参考序列比对，可以轻松验证克隆。

• 限制性酶切需要使用不同的限制性内切酶在不同位点切割质粒DNA。如果克隆正确，将会产生预期大小的条带。

通过PCR进行鉴定

图8.质粒琼脂糖凝胶

最终产物

根据你的克隆目标，你可能只需将步骤1到步骤5完成一次，然后继续实验的其他部分。而在其他情况下，你可能需要重复“循环”这些步骤，直到项目完成。因此，我们可以用流程图来表示克隆周期的各个步骤。

图9.质粒克隆流程图

克隆成功的一般技巧

提示1：谨记墨菲定律

如果一件事情可能会出错，那么它就会出错。然而，遵循以下分享的技巧，你可以避免克隆过程中可能出现的问题。

提示2：理解实验流程并学习每一步骤的必要性。

当开始使用克隆实验流程时，必须了解流程中每一步的目的。随着对流程和技术的逐渐熟悉，你将了解到哪些步骤是关键步骤并需要精准操作或定量，以及哪些步骤可以灵活对待

提示3：准备充足且高质量的核酸。

高浓度且高纯度的原始材料能够极大提高实验的顺利程度。为了获得高浓度且高纯度的DNA，必须严格遵循DNA纯化程序。在实验过程中，稀释物质比浓缩更容易。DNA的质量至关重要，因此必须确保DNA的纯度

提示4：精确测定核酸的含量。

确保对于微量DNA样品的准确定量。

提示5：谨慎保存和处理DNA

将DNA冷冻保存，以防紫外线和氧化损伤。从琼脂糖凝胶纯化DNA时，避免将其长时间暴露于短波紫外线（UVB），应使用较长波长的紫外线选项（UVA）或配备适当染料的非紫外线灯，以避免损害DNA。

提示6：理解摩尔比例

许多实验流程都会给出所需的摩尔比例，因此你必须了解DNA质量与摩尔浓度之间的关系。DNA分子的质量与其长度成正比。

提示7：精确移液

通过移液引入的偏差越小越好。精确的移液操作能确保测量准确，并得到可靠的重复结果。

提示8：仔细复核

进行分子生物学实验和克隆时，必须仔细复核你的计算。此外，要熟悉不同体积在移液器和Eppendorf管中的外观，还要仔细检查标签。

提示9：保留中间产物

在克隆过程中保留中间产物对于应对突发失误非常有帮助。保留反应剩余物能让你在必要时重复某些步骤。例如，当连接产物转化发生问题时，如果保存了一部分连接产物，就 可以根据需要重新进行转化。

提示10：安全储存并准确记录你的最终产物

大多数试剂都有最佳储存条件，不遵守这些指南可能导致材料降解，从而引起实验失败，浪费时间和金钱。

提示11：不要依赖试剂盒

当你了解了每一步操作到底是在做什么时，试剂盒才能发挥它的最大效果。这一点在实验出现问题时尤为重要。对流程的理解将使你能够有效地排查问题。

提示12：简化你的克隆操作

尽可能地减少克隆流程中的步骤。步骤越多，出错、产物损失、标签错误和序列突变的风险就是越高。

关键克隆技术

限制性内切酶克隆

限制性内切酶克隆是一种常用的技术，通过限制性内切酶准备克隆所需的插入片段和载体。限制性内切酶能够使载体和插入片段在特定位点被切割，这样它们就可以被DNA连接酶轻松连接起来，形成重组DNA。

Gateway克隆技术

Gateway克隆是一种能够替代限制性内切酶克隆的非常高效的方法，无需使用限制性内切酶。这种两步重组过程可以利用整合和切除反应，将插入片段转移到载体中。多位点Gateway克隆允许同时插入四个片段之多。

Gibson组装

Gibson组装是一种高效且易于使用的克隆方法，无需使用限制性内切酶，多个具有重叠序列的DNA片段可以在单个反应中同时插入到质粒中。

In-Fusion克隆

In-Fusion克隆是一种灵活的方法，用于在不使用连接酶的情况下创建无缝的基因融合。将线性化的载体与一个或多个具有重叠末端的PCR产物混合，然后In-Fusion酶就可以通过单一步骤将其连接起来。

TA克隆

TA克隆是一种简便的克隆技术，无需使用限制性内切酶。该技术利用DNA聚合酶在PCR产物的3’末端添加A突出端，从而使这些PCR产物能够通过粘性末端连接（A与T互补配对）进入带有相应T突出端的载体中。

TOPO克隆技术

TOPO克隆技术使得PCR产物能够通过拓扑异构酶I迅速与线性化质粒载体连接，无需依赖DNA连接酶。TOPO克隆包括三种类型：粘性末端TA克隆、平末端克隆和定向克隆。

衍因智研云和质粒克隆周期

衍因智研云为用户提供了一系列用户友好型工具，这些工具能够支持简单及复杂克隆项目的实施，使其更加便利。通过衍因智研云，您可以规划克隆策略，直观地观察克隆过程，并记录您的工作。衍因智研云的工具能帮助您避免实验操作中的错误和时间的浪费，从而提高实验台工作的效率与准确性。

衍因智研云助您优化克隆流程：

1. 专业的克隆工具，确保针对所有主要分子克隆技术的构建设计快速且准确。

2. 通过直观地将测序结果与您模拟的构建体进行比对，以及模拟琼脂糖凝胶电泳的过程，确保克隆结果的精确验证。

3. 自动化的文档记录工具，详尽记录您的实验步骤，并生成图形化实验历史记录。

4. 数据管理工具，帮助您存储、导入、分享以及整理图、文件和序列信息。